Depart. B.E.&B.Ch. > IDEI - Evaluarea stabilităţii genetice a unor soiuri de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) românesti de elită în urma crioconservării

English

Contract 280/5.10.2011

Titlu proiect: Evaluarea stabilităţii genetice a unor soiuri de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) românesti de elită în urma crioconservării.

Denumirea Programului din PNII: IDEI

Finanţare: Bugetul de Stat 

Valoarea contractului: 1397000 lei 

Durata contractului: 36 luni 

Contractor: Institutul de Cercetări Biologice Cluj-Napoca filială a Institutului National de Cercetare-Dezvoltare pentru Ştiinte Biologice, Bucureşti 

Autoritatea contractantă: Unitatea Executivă pentru Finanţarea Învăţământului Superior, a Cercetării, Dezvoltării şi Inovării – UEFISCDI 

Director de Proiect: Dr. Adela Halmagyi (adela.halmagyi@icbcluj.ro)

Rezumat

În ultima perioadă de timp se înregistrează un grad de conștientizare tot mai ridicat referitor la necesitatea conservării resurselor genetice vegetale nu numai pentru menținerea biodiversității ci şi pentru a veni în sprijinul biotehnologiilor şi a programelor de înmulţire a speciilor vegetale. Crioconservarea implică o serie de factori de stres la nivelul materialului vegetal, factori care ar putea induce modificări în materialul vegetal regenerat după crioconservare. Condiția sine qua non pentru o crioconservare de succes este menținerea stabilităţii genetice a materialului vegetal regenerat după stocare. Din acest motiv este de necesară evaluarea plantelor regenerate după crioconservare vs. plantele donor de explante. Simpla conservare a germoplasmei fără o caracterizare a resurselor în cauză nu poate fi eficientă pe termen îndelungat şi în condiţiile unei agriculturi durabile. Conservarea resurselor vegetale pleacă de la premisa ca materialul vegetal să fie conservat în condiţii care îi menţin stabilitatea genetică. Acest proiect are ca scop conservarea resurselor genetice la cinci soiuri de tomate de importanță economică prin aplicarea metodei de crioconservare (stocare azot lichid la -196°C) și ulterior evaluarea stabilității genetice a genotipurilor conservate. Acest aspect va fi analizat la nivel molecular pentru detectarea eventualelor modificări genetice prin utilizarea markerilor AFLP și secvenţierea ADN pentru identificarea genei care codifică licopen β-ciclaza, înainte şi după crioconservarea materialului vegetal. Tomatele (Lycopersicon esculentum Mill.) sunt o specie diploidă cu un număr de 12 de cromozomi și o dimensiune a genomului de aproximativ 950 Mb. Roşiile conţin licopen, unul dintre cei mai puternici antioxidanţi naturali reprezentând până la 90% din totalul carotenoidelor. Acești compuși au un impact pozitiv ridicat în domeniul sănătății astfel încât tomatele au fost considerate ca şi aliment functional. Consumul de tomate a fost asociat cu un risc scăzut de cancer de sân, cap sau prostată şi ar putea fi un puternic protector împotriva bolilor neurodegenerative. S-a demonstrat faptul că licopenul și β-carotenii au un rol cheie împotriva anumitor tumori și boli cardiovasculare. Licopen β-ciclaza este o enzimă cu rol crucial în lanţul biosintetic al pigmenţilor carotenoidici din plante. Această enzimă este implicată în sinteza α-şi-β-carotenilor care sunt ulterior convertiţi în carotenoizi cum sunt luteina sau zeaxantina. Genomul tomatelor conține două tipuri de gene care codifică licopen β-ciclaza din cloroplast (LCY-B şi CYC-B). Analizele vor stabili dacă și ce influente sunt eventualele mutaţii în structura genei implicate sau măsura în care ar putea afecta sinteza β-ciclazei.

Obiective

Obiectivul general: Analiza stabilității genetice la cinci soiuri de tomate româneşti de importanță economică regenerate din apexuri crioconservate vs. plantele donor de explante.

O1: Evaluarea resurselor studiate în conformitate cu cerințele legislative interne pentru soiurile de tomate.

O2: Elaborarea unui model experimental bazat pe metodele de analiză utilizate pentru identificarea variabilităţii genetice. Stabilirea metodelor experimentale care urmează să fie utilizate pentru crioconservarea soiurilor de tomate, analiza AFLP și secvenţierea genei.

O3: Dezvoltarea și optimizarea unui protocol de crioconservare pentru genotipurile de tomate luate în studiu. Acest protocol se va baza pe rezultatele anterioare obținute (protocoale bazate pe tehnica vitrificării) pentru alte specii vegetale. Parametri cum ar fi dimensiunea apexului caulinar, durata preculturii şi a deshidratării sau diferite modificări biochimice care au arătat o corelație pozitivă cu regenerarea post-crioconservare vor fi luate în considerare pentru creşterea eficienţei protocoalelor existente.

O4: Analiza AFLP a soiurilor de tomate și secvențierea genei care codifică licopen β-ciclaza înainte de crioconservarea materialului vegetal. Markeri AFLP legaţi de locusul beta vor fi obținuţi înainte de apariţia eventualelor modificări genetice apărute ca urmare a aplicării metodelor criogenice. După crioconservarea materialului vegetal această structură va fi utilizată pentru analizarea stabilităţii genetice sau a polimorfismului apărut ca urmare a temperaturilor foarte scăzute.

O5: Validarea protocoalelor de crioconservare optimizate. Este de așteptat ca o mai bună înţelegere a mecanismelor implicate în toleranța față de temperaturile ultra-scăzute (-196°C) va conduce de asemenea la detectarea unor gene sau proteine implicate în rezistenţa la frig.

O6: Evaluarea AFLP a polimorfismului la soiurile de tomate după crioconservarea materialului vegetal și detectarea eventualelor modificări genetice în structura markerilor AFLP.

O7: Identificarea stabilității genetice la plantele regenerate după crioconservare in raport cu plante donor de explante. Este necesară evaluarea stabilităţii genetice a plantelor regenerate după stocare pentru a stabili dacă acestea nu au suferit modificări după crioconservare. Acest lucru va fi realizat la nivel molecular prin secvenţiere ADN a genei cloroplastice care codifică licopen β-ciclaza după crioconservarea de material vegetal și se va stabili dacă și ce fel de mutații au apărut în structura genei implicate care ar putea afecta sinteza licopen β-ciclazei.

Rezultate

2011

Conservarea resurselor vegetale pleacă de la premisa ca materialul vegetal să fie conservat în condiţii care îi menţin stabilitatea genetică. Din aceste considerente caracterizarea şi evaluarea sub toate aspectele a materialului vegetal ce urmează a fi supus conservării cât şi a celui regenerat după crioconservare este esenţială. În ţara noastră cadrul ecologic oferă condiţii climatice naturale favorabile pentru sistemele de cultură a tomatelor iar producerea, prelucrarea şi/sau comercializarea seminţelor şi a materialului de plantare sunt reglementate prin lege (Legea 112/2007-privind producerea şi valorificarea legumelor). Soiurile de tomate de importanţă economică luate în analiză în vederea crioconservării şi a stocării pe termen îndelungat a germoplasmei au fost caracterizate prin parametri de cultură şi descriptori morfologici.

2012

Crioconservare

Seminţele de tomate au fost furnizate de către Institutul de Cercetare şi Dezvoltare pentru Legumicultura şi Floricultura, Vidra. Seminţele mature vor fi utilizate pentru inducerea culturilor in vitro. Culturile stoc de plante de tomate vor fi crescute la o temperatura de 24°C, cu o fotoperioada de 16h lumina / 24h şi apoi folosite ca plante donor de explante pentru crioconservarea prin vitrificare. Succesul acestei tehnici de congelare este asigurat prin îndepartarea apei din celule care ar putea forma cristale de gheaţă letale în interiorul celulelor în timpul imersiei acestora în azot lichid (la o temperatura de -196°C). Ţesuturile vegetale nu ar putea supravieţui expunerii la o temperatură atât de scăzută fără aplicarea unor tratamente crioprotectoare. Dupa stocarea materialului vegetal în azot lichid urmează decongelarea şi transferul inoculilor pe mediu nutritiv pentru regenerarea de plante.

2013

Analiza AFLP şi secvenţierea

Analiza AFLP se bazează pe amplificarea selectivă a fragmentelor de digestie rezultate din ADN şi este o metoda rapidă care se poate folosi şi în tehnici ca ADN fingerprinting, gene tagging, cartarea genomurilor de densitate mare, selecţie marker-asistată şi clonarea poziţională a genelor (Cervera şi colab., 1996; Hill şi colab., 1996). Tehnica AFLP are capacitatea de a detecta polimorfisme în diferite regiuni genomice în mod simultan. Este o tehnică extrem de sensibilă şi beneficiază de o puternică reproductibilitate a rezultatelor obţinute. Datorită acestor avantaje tehnica AFLP a devenit larg utilizată pentru identificarea variabilităţii genetice între specii înrudite de plante, fungi, animale sau bacterii. Aceasta tehnică nu are doar o mare reproductibilitate, rezoluţie şi sensibilitate la nivelul întregului genom comparativ cu alte tehnici dar poate de asemenea amplifica între 50 şi 100 de fragmente concomitent fără a fi nevoie de vreo informaţie prealabilă despre secvenţele care urmează să fie amplificate (Meudt şi Clarke 2007). AFLP a fost frecvent utilizată în analiza taxonilor vegetali, unde nu se stiu multe lucruri despre felul în care este alcatuit genomul. În urma analizelor se va efectua o secvenţiere ADN a genei responsabile de sinteza licopen β-ciclazei, folosind un analizor genic pentru stabilirea fidelităţii genetice a materialului crioconservat în raport cu plantele donor. Secvenţierea ADN se va efectua în urma amplificării PCR a genei cu amorse specifice urmată de purificarea din gel. ARN-ul total va fi extras din frunzele celor cinci soiuri de tomate supuse analizelor folosindu-se un kit de extractie şi azot lichid. ADNc al genei responsabile pentru sinteza de licopen beta ciclază va fi sintetizat prin transcriere inversa folosindu-se SupeScriptTM II Reverse Transcriptaza şi amorse specifice. Fragmentul ADNc obţinut se va folosi pentru amplificarea PCR a genei. Pentru determinarea stabilităţii genetice sau a polimorfismelor apărute în structura genei responsabile de sinteza licopen beta ciclazei, datorate crioconservării materialului vegetal, toate cele cinci soiuri de tomate vor fi analizate atât înainte cât şi după crioconservare, prin AFLP şi secvenţiere.

2014

Evaluarea stabilitatii genetice si a „true-to-typness” la plantele regenerate dupa crioconservare vs. plantele donor.

Asigurarea integrității genetice a materialului conservat este de importanță vitală pentru conservarea germoplasmei de calitate și pentru utilizarea ei ulterioară. Așadar, în cazul crioconservării, scopul major este de a menține materialul vegetal stabil din punct de vedere genetic. Crioconservarea poate induce stres materialului vegetal ceea ce ar putea afecta stabilitatea genetică sau ar duce la modificări epigenetice. Există mai multe metode care au fost /sunt utilizate în mod curent pentru analiza integrității materialului vegetal crioconservat (RAPD, RFLP, SSR, AFLP, MSAP), una dintre ele fiind secvențierea unei gene candidat. Avantajul major al acestei abordări îl reprezintă verificarea rapidă a potențialelor modificări induse de crioconservare unor gene cu rol metabolic crucial. Integritatea genei LCY-B a fost scanată după procesul de crioconservare la cinci soiuri de tomate (Lycopersicon esculentum Mill., cvs. ‘Capriciu’, ‘Darsirius’, ‘Kristin’, ‘Pontica’ și ‘Siriana’). S-au luat în studiu din fiecare soi câte cinci indivizi regenerați după crioconservare și câte cinci indivizi control cultivați in vitro dar care nu au fost supusi crioconservării. Ca urmare a a studiilor efectuate s-au constatat urmatoarele:

- Secvențele genei LCY-B analizate după aplicarea procesului de crioconservare prezintă o identitate de 100% cu secvențele control care nu au fost supuse crioconservării;

- Mutația SNP obținută în poziția 1139 constând dintr-o transversie G→T nu reprezintă o consecință a procesului de crioconservare ci desemnează soiurile ‘Capriciu’ și ‘Darsirius’ ca fiind mutante pentru această genă;

- Arborele NJ generat pe baza secvențelor obținute prezintă o grupare bazată exclusiv pe mutația identificată și nu pe considerente care țin de aplicarea tehnicii de crioconservare.